肠道微生物基因组测序需要多少钱

全基因组测序，就是检测出全部30亿个碱基对是怎么排列的，从第一个到第30亿个，一个都不落下。它是检测人类所有基因组信息，不针对任何单个疾病或者因素的基因，但又囊括了之前所有单个基因检测要用到的信息。要根据基因组的大小决定的。而且选择测序的仪器也有区别。您如果自己购买仪器测序价格自然又有不同了。比如测一个5M的基因组，基本上用第二代测序仪器一个run即可完成，大概需要15万RMB（含税价格）。

一代测序

首先讲一下测序的基础方法，Sanger测序 (Sanger et al.,1977)

1977年Frederick Sanger和同事发展出双脱氧测序法（dideoxy sequencing method）或称链终止法，并对噬菌体phiX-174测序以来，测序原理并未有太多变化。后来测序方法的改革也几乎都是在此基础上，缩短时间，降低人力，比如①在每一种ddNTP中掺入不同的荧光标记，使测序在单一反应中就能进行。②使用极薄极长的充胶玻璃毛细管代替大的聚丙烯酰胺凝胶块，新的介质散热更快，使电泳能在高压下进行，降低分离时间等诸如此类的减少分离时间的变革。③更换探查单一核苷酸的方法，用微转换器控制通过的电流检测核苷酸等等。

Sanger法测序需要引物，DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）。按照碱基配对原则，dNTPs在引物之后按照模板延伸，ddNTPs的随机加入会由于它缺乏连接下一个的3’羟基而导致反应终止，由于ddNTPs的结合位置随机，我们会得到一系列大小不同的片段，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或同位素标记进行检测。也正是这个原理，所以测序得到较长的序列的概率低，长序列往往需要双向测序再进行拼接。

Maxam gilbert 化学法测序 (Maxam and Gilbert,1977)

几乎同时，Maxam和Gilbert发明了化学链降解法测序。

通过化学终止反应测序。首先双链变单链，准备工作完成。采用特定的化学试剂来从DNA链上断裂特定碱基，在5’端磷酸化（32P），四种化学反应：G反应，A+G反应，T+C反应，C反应，分别进行并产生一系列片段。然后进行电泳（electrophoresis），放射自显影（radioautography），最后可以整理得到序列。

二代测序（目前拥有这些测序仪的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收购life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官网可以找到这些测序仪），Roche）

一些和前后都没有紧密联系的概念

深度测序（deep sequencing）不是什么测序方法，而是根据对目的基因测序的depth和coverage（C）对测序方法的归类。如果这个片段被测序了大于7次（coverage>7），那么基本可以说是深度测序，大于100×称为ultra deep sequencing。还有一些概念比如length of genome（G）指全基因组长度，number of reads（N）片段数量，average read length（L）。

C=N×（L/G）

pyrosequencing 焦磷酸测序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代测序 (Jarvie, 2005)

焦磷酸测序法

它后来发展称为Roche公司454技术所使用的测序方法。

是一种酶联级联测序技术，准确度可与Sanger媲美，且速度大大提高。具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量，低成本，快速地进行单核苷酸多态性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技术支持。改进后的焦磷酸测序技术可以满足上百个核苷酸测序。但是测序长度一般在100bp左右，一直用于短序列分析。它的技术原理是4种酶在同一反应体系种级联化学发光反应，引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），荧光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）协同作用下，检测荧光，实时测定DNA序列。

454测序-固定的焦磷酸测序体系（2016年被Roche公司淘汰）

首先是序列处理：全基因组DNA处理为小的片段（鸟 *** 法处理的），在一端连接两端分别连接A和B（可以在PCR中产生大量的目的序列），然后解链变成带有adaptors的单链DNA，这个adaptorA的序列可以与小珠子上面的短序列B匹配，这样我们要测序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且与酶不反应的分子，作为固定表面。然后进行乳化PCR，得到了满载分子的小珠子并将它们放入小孔。接下来是焦磷酸测序的原理，引物是adaptorA，每次反应加一种dNTP，如果可以碱基配对，会在DNA聚合酶下结合在引物末端，释放一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi与APS结合形成ATP，ATP与荧光素在荧光素酶作用下形成氧化荧光素，产生可见光。反应后冲洗掉剩余dNTP和少量ATP。

大多数现代测序方法都是分为这几步，主旨是实现高通量和自动化。①全基因组片段化。②adapter ligation末端连接短序列。③目标DNA与分子小珠子的结合。④将小珠子加载到孔板。⑤采用适合的方法测序。⑥数据处理。

连接酶法测序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID测序  (Hedges et al.,2011)

连接酶测序法

利用的是DNA ligase的一个特性。连接酶是将DNA分子末端连接在一起的酶，它对DNA结构敏感，如果两条链的碱基不匹配，那么酶的效率很低。

具体如下图，模板链连接P1Adaptor，引入引物Pn与探针寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前两个是与模板结合的碱基，中间三个为universal配对，后三个也是且5’连接荧光标记。在酶的作用下，正确配对的探针偏向与模板结合，然后荧光信号被检测并切除，露出5’端，继续反应。中间NNN的碱基部分可以通过加入引物Pn-1的方法，进行错位测序，之后整合数据。

ABI公司SOLID测序平台

在前期准备上与454测序相似，也会用到小分子的beads。但是测序方法为连接酶法，不是焦磷酸。

鸟 *** 法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 测序- Ion torrent 公司PGM测序 (Merriman et al.,2012)

鸟 *** 法

传统的sanger法适合短一些的序列，当处理比如人类基因组的长序列时，需要鸟 *** 法将长序列变成短序列。并不是一个独特的测序方法，应该算是前处理技术。这些通过鸟 *** 法处理得到的短序列位点和长度随机，称为contigs（重叠群/连接片段）。然后用不同的测序方法测序，将结果输入电脑，它用算法（algorithm）将contigs的重叠部分进行拼接，得到完整序列。

Ion Torrent公司Proton测序仪

此方法比较快速。测序的原理与其他的不同，检测的不是荧光信号，而是核苷酸结合时释放的氢离子H+。同样全基因组→片段化，单链→连接adaptor→adaptors配对连接beads小分子→乳化PCR amplify。这些步骤与其他二代测序一样，不同的是Ion Torrent采用半导体芯片代替之前的孔板，加载携带序列的小分子在芯片上，芯片由可以承载小分子beads的孔和感受pH的传感器构成，这样前期准备就完成了。测序也是逐个加入四种核苷酸，检测产生的氢原子对溶液pH的影响，收集处理信号。

illumina 公司测序平台目前占据大部分市场，以HiSeq系列为主 (Quail et al., 2008)

特点是很便宜，速度也很快。①前期对基因组的片段化以及两端连接adaptorA,B与其他二代测序技术类似，②不同的是它没有用beads，核心反应容器是可以吸附流动DNA片段的测序流动槽（flowcell），每个flowcell上有8个道（lane），lane上面有与adaptorA,B相互配对的序列，所以可以固定DNA。③桥式PCR扩增与变性。先因为adaptorA,B序列而结合，形成拱桥性状，开始扩增，完成后双链和两端会再变性分开，新产生的单链作为模板再开始桥式反应。最后的结果是会产生一簇正反向的目的片段（详见下图）。④测序，检测荧光信号，整合结果。

第三代测序

PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies纳米孔单分子测序技术被称为第三代测序技术。其特点是不需要进行扩增，就是说小分子beads/桥式PCR的步骤是不需要的，而且产生的reads（读长）较长（>20kb）。

PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015)

这个方法有点在上面提了，且速度快，由于是实时检测，所以还可以检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。但是缺点是错误率太高，以缺失序列和错位居多。SMRT芯片为测序载体（如同flowcell），不同碱基用不同荧光标记，在合成配对时检测荧光信号。

实现实时长序列测序的关键第一是采用的DNA聚合酶的活性保持，第二是区分配对的反应信号与周围游离碱基的强大背景荧光，采用零模波导孔原理，在反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多圆形纳米小孔达到降噪检测的目的。

Oxford Nanopore  的MinION (Mikheyev and Tin,2014)

是基于电信号的测序。它的特点是仪器真的非常小，reads更加长（几十甚至上百kb），而且DNA在测序中不被破坏，但是错误率同样很高。它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理，这是因为存在表观修饰的碱基激发的电流强度是不同的。这对于在基因组水平直接研究表观遗传等相关现象有极大的帮助。

技术核心是特殊的纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

参考文献

Albrecht, G., Brenner, S., Dubridge, R.B., Lloyd, D.H., and Pallas, M.C. (2000) Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors. In: Google Patents.

Hedges, D.J., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A. et al. (2011) Comparison of three targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform.  PloS one   6 .

Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies.  Drug Discovery Today: Technologies   2 : 255-260.

Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA.  Proceedings of the National Academy of Sciences   74 : 560-564.

Merriman, B., D Team, I.T., and Rothberg, J.M. (2012) Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.  Electrophoresis   33 : 3397-3417.

Mikheyev, A.S., and Tin, M.M. (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer.  Molecular ecology resources   14 : 1097-1102.

Quail, M.A., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, P.J., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.  Nature methods   5 : 1005.

Rhoads, A., and Au, K.F. (2015) PacBio sequencing and its applications.  Genomics, proteomics &bioinformatics   13 : 278-289.

Ronaghi, M. (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.  Genome research   11 : 3-11.

Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.  Proceedings of the national academy of sciences   74 : 5463-5467.

Sutton, G.G., White, O., Adams, M.D., and Kerlavage, A.R. (1995) TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects.  Genome Science and Technology   1 : 9-19.

只要通过人体的一部分组织，如血液、头发等，就可以预知将来是否会出现肿瘤、老年痴呆、急性重症心脑血管疾病等，基因测序可以做到。昨天，记者探访了江苏省中医院病理科，这是我国惟一接受社会人员进行基因测序的地方。

测基因有什么用?

基因预知未来健康状况

省中医院病理科主任赖仁胜介绍，与B超、CT等检测不同的是，基因检测有“将来时”的意义。就拿肿瘤来说，当人体内的抗肿瘤基因发生突变后，就会变得很脆弱。不过，突变后的基因是否会发生癌变，很大程度取决于环境因素，如果生活方式不当，基因突变者往往有80%—90%在10—15年后就容易发生癌变。目前，已发现有6000多种疾病与基因和遗传有关，如先天性耳聋、腭裂、老年痴呆、急性重症性脑血管疾病、先天性小脑畸形等等。不过，其中只有不到100种是完全取决于基因的变化，不需要环境因素影响。

>>>案例

三五年内胃不会癌变

50多岁的刘先生（化名）是南京某公司驻海外公司的老总，但是，自从去年他查出患有萎缩性胃炎后，就不再愿意出国工作了，因为萎缩性胃炎癌变的可能性较高，他担心在国外出事。刘先生在省中医院基因测序发现，“掌控”他是否会患癌的P53基因还没有突变，这就说明他在三五年内是不会癌变的。赖仁胜说，有高危因素但还没有出现基因突变的人三五年后要再检测一次。100多人预测心脑血管病

因为父母中有人死于重症心脑血管疾病，而且自己也有高脂血症等，有100多位这样的病人前往省中医院，要求预测是否将来会出现脑溢血、冠心病等。检测后，却意外地发现部分人将来会出现老年痴呆。赖仁胜告诉记者，是否出现急性重症心脑血管疾病关键在于看APOE基因的表现，APOE基因的6种不同表现中，APOE4预示着患老年痴呆的可能。在这100多人中，发现拥有APOE4基因的有17人。

基因测序怎么做？

做基因测序费用在1000多元

昨天，记者在省中医院病理科看到，虽然基因测序室并不大，但是，专家表示，要把个体基因判读出来，则需要在不同仪器上来来回回“走”无数遍，因此需耗时10天左右。在该科，一般用于基因测序的是肿瘤组织或者血液标本，当技术人员从标本中抽取出DNA后，要选取出合用的DNA则是一项相当繁琐的工作，因为这需要无数次的检测，所以也特别耗时。选取成功后，就要上DNA测序仪测序，然后由专业技术人员判读、分析，再与国际惟一的标准比对，才能为检测者提供基因建议。随着基因研究的深入，国外除了医院，很多基因公司、网站都对外开展基因测序项目，不过，在我国这项工作更多的还是处于实验室，只有省中医院面向社会开放。赖仁胜解释道，并不是其他医院没有这项技术，最重要的一点是很多地方都没有收费标准。“我们能面向社会开展基因测序，还得感谢省物价局。虽然国家有政策允许医院开展基因测序，但是，我国目前只有江苏省物价局对基因测序收费进行了定价，其他地方因为没有定价也就无法面向社会开展。”说到此，记者明显感觉到了赖仁胜的遗憾。

据透露，做基因测序取决于基因长度，费用不等，大概在1000多元。

什么人需要测？

建议高危人群检测基因

对于基因测序，赖仁胜表示有三大原则：高危人群鼓励做；与疾病有关的人群必须做；一般人群思考后再做。对于高危人群的定义，赖仁胜称，主要是指家族中有老年痴呆、急性重症心脑血管疾病或者肿瘤病人，或者出现了萎缩性胃炎、乳腺囊性增生症、宫颈不典型增生、肝硬化等癌前病变者。之所以建议这类人群接受基因检测，赖仁胜解释道，因为这些人检测或不检测都会处于忧虑之中，担心发生癌变或者和家人出现相同的疾病，检测后如果没有发现致病基因，那就可以放下心来，如果发现了致病基因，则可以积极、科学地寻找干预、治疗措施。赖仁胜还认为必须做检测的病人则主要是肿瘤病人。

团体检测全都被拒

省中医院对外开展基因测序至今已将近一年，赖仁胜说：“我们至今为400多人做了基因测序，基本上都是本院的住院病人，只有1/4左右是自己来主动要做的，不过并不是没有人愿意做，很多人被我们劝阻了。”对于临床意义不明显、家庭没有遗传疾病、个人没有癌前病变，主要是恐惧自己的未来健康，一般都会被劝阻做基因测序。

除此之外，团体检测几乎都会被拒。赖仁胜告诉记者，南京某事业单位曾要求为单位的20多名干部进行基因测序，不过，被赖仁胜开出的3000元一人的高价吓退了。赖仁胜笑道：“其实基因测序根本没有这么贵，只是我们得罪不起这样的单位，只能开高价吓唬。”至于不做集体检测的理由，赖仁胜表示，基因突变的几率在普通人群中在10%以下，这些人没有高危因素，那么检测出来就可能都是正常的，但是拿到一样报告的单位则不这么认为，会对基因检测产生误解。