DNA可以改变。生物学上称之为基因突变。

基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。

一个基因内部可以遗传的结构的改变。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化。广义的突变包括染色体畸变。狭义的突变专指点突变。实际上畸变和点突变的界限并不明确，特别是微细的畸变更是如此。野生型基因通过突变成为突变型基因。突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。

基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。基因突变为遗传学研究提供突变型，为育种工作提供素材，所以它还有科学研究和生产上的实际意义。

脱氧核糖核酸（英语：Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA）又称去氧核糖核酸，是一种最重要的生命基础分子，可组成遗传指令，以引导生物遗传、生物发育与生命机能运作。

主要功能是长期性的信息储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的信息，是建构细胞内其他化合物的最终源头。带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表达。DNA是一种长链聚合物，其基本组成单元称为核苷酸，其中的脱氧核糖与磷酸借由酯键相连，组成DNA长链的骨架。每个糖单位都会与某一种碱基相连，组成生物界DNA的碱基主要有四种，分别称为A、T、C、G，这些碱基沿着DNA长链排列，形成的序列，即是遗传信息，用以指导RNA的合成，进而指导蛋白质的合成。

参考资料

：http://msogoucom/web/uID=Cew6W3FsSnHflDfk/v=5/type=1/sp=1/ct=171218223306/keyword=DNA%E5%8F%AF%E4%BB%A5%E6%94%B9%E5%8F%98%E5%90%97%3F/id=21042462-4cc0-4334-bd53-efd9e0c85a32/sec=Z7e6QyPSK-5IsdqG0g7_XA/vr=30000201/tckey=DNA%E5%8F%AF%E4%BB%A5%E6%94%B9%E5%8F%98%E5%90%97%3F&pno=1&g_ut=3&pid=sogou-waps-8ce8b102d40392a6&dp=1&is_per=0&clk=3&url=https%3A%2F%2Fzhidaobaiducom%2Fquestion%2F918385169016965419&vrid=30000201&wml=1&linkid=0&mcv=20&pcl=303,541&sed=0&ml=10&sct=73

一、亲缘关系鉴定包括什么

1、全同胞鉴定：同父同母的全同胞关系确认。

2、半同胞鉴定：可分为同父异母或同母异父的兄弟姐妹鉴定。

3、父系亲缘关系鉴定：如爷孙，叔侄，兄弟，堂兄弟，堂叔侄(只要是来自于同一个爷爷的男性后代)都可以进行鉴定。

4、母系亲缘关系鉴定：如外祖母和外孙子/外孙女，姨妈和外甥/外甥女。只要是来自于同一个外祖母的女性后代都可以进行鉴定。

5、家族谱系鉴定：同一姓氏，同一家族的男性成员的鉴定。

6、abo血型的基因鉴定：最准确的一种血型鉴定方法，适用于许多用常规方法无法检测的样本。如陈旧血痕或非血液类样本;某些特殊血型的验证等。

7、dna同一认定：确定几种不同来源的样本是否为同一人或某个人所留。包括白血病骨髓移植的植入诊断。

8、动物的亲缘鉴定：各种哺乳动物都可进行鉴定，包括牛，狗，马，羊等。

9、细胞系的鉴定：对是否来自于同一细胞系或细胞株的同一认定。

二、做亲子鉴定的程序

(一)做亲子鉴定有哪些手续

做亲子鉴定需要哪些手续请看以下几点说明：

(一)私人做亲子鉴定应到当地司法部门办理委托手续。

(二)当事人必须提供身份证(护照)、出生证、结婚证等有效证件的正本，由鉴定单位的工作人员核对和验证身份无误后，复印存档，正本当即归还当事人。

(三)当事人亲笔填写“亲子鉴定申请书”，包括当事人的基本情况、申请原因等。孩子年幼无书写能力的，可由父母代为填写，再由小孩按手印确认。

(四)亲子鉴定单位给当事人拍照存档，合影照片将用于亲子鉴定报告。

(五)采集每位当事人的血样，每人采血2—3毫升;采血完毕，要求被采血当事人签名，并由当事人按指纹确认;当事人缴付亲子鉴定费用。

(二)做亲子鉴定经过什么步骤

第一步：dna提取

把样本细胞核中所含有dna提取出来，然后进行一定的纯化，化除样本中的杂质。

第二步：pcr扩增

pcr的中文名为聚合酶链式反应，简单的说，pcr扩增这一步就是把我们所需要的片段通过酶促反应，在pcr仪上进行大量复制，放大到通过某些专用仪器可以看到的程度。

第三步：后pcr反应

这一步主要是上测序仪检测的准备阶段，将双链的dna打开，加一些检测用的的内标，主要是用来标记检测的片段长度。

第四步：毛细管测序仪检测

个人隐私鉴定：不需要出具相关的证明，但是出具的报告不具有法律效力，只能知道准确的结果，可以自行采集样本后现场送样或者邮寄。

司法亲子鉴定：大人需要带上身份证，小孩子有身份证、出生证和户口本必须带上

（没有证件的则到现场填写准确的出生年月日。）必须本人亲自到现场办理手续，大人和小孩一起去现场采集样本，拍照，按指纹；

如系公检法机关委托的鉴定，出具由法院、检察院、公安部门或律师事务所签发的亲子鉴定委托书，注明父母和孩子的姓名、地址、身份证以及申请原因等。

关于亲子鉴定的问题可以咨询暨南大学司法鉴定中心。

用于基因工程的工具酶

一,限制性内切酶(Endonucleosase)

(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类

1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:

hsd R---限制性内切酶

hsd M---限制性甲基化酶

hsd S---控制两个系统的表达

1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础

截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种

2)限制性核酸内切酶可分为三大类:

I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性

II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断

III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部

因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶

(二)II类限制性内切酶的命名及特性

命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子

如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上

(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点

绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5'-GAATTC-3'

DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:

钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等

粘端(粘性末端)如:EcoR I等

图2-1 限制性内切酶产生的末端

(四)识别位点在DNA分子中的频率

对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个

二,甲基化酶

在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应

(一)大肠杆菌中的甲基化酶

dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同

dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II

(二) 甲基化酶在基因工程中用途

许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割如:MEcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割

三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase)

来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因,脱水形成3'-5'磷酸二酯键

连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端

连接RNA模板上的DNA链缺口

连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接

图2-2 连接酶的作用方式

四,核酸酶

作用: 降解磷酸二酯键

分为:外切酶 内切酶

(一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性依赖于Ca2+

用途:

构建限制酶图谱

产生末端缺失突变

DNA超螺旋线性化

(二)E coli外切酶III

只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子

(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)

特性:

1 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度

2 降解发生的方式为内切和外切

3 酶切活性需40-45pH环境,Zn2+激活

4 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍

(四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链

五,聚合酶

(一)DNA聚合酶I

5'-3'聚合酶活性

3'-5'外切酶活性

5'-3'外切酶活性

核酸内切酶活性

可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子

图2-3 DNA聚合酶I

(二) Klenow酶

该酶无5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用该酶:

修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端

标记DNA探针

催化cDNA第二条链的合成

末端终止法测序

图2-4 Klenow 酶的作用方式

(三) T4 DNA聚合酶

与Klenow酶相似,外切酶活性更高体外诱变反应中效率很高

(四)T7 DNA聚合酶

测序酶

(五) Taq DNA聚合酶

耐高温,主要用于PCR反应

(六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA

AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒)

DNA聚合酶活性

RNase H活性

DNA内切酶活性

核酸结合活性

M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)

两种逆转录酶的区别

肽链的组成

禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性

鼠酶1条,较弱的RNase H活性

反应的最适温度

禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高

反应的最适pH值

禽酶pH 83

鼠酶pH 76

六,DNA修饰酶

有大量的修饰酶,主要的有以下几种:

1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基团

2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5'端增加磷酸基团

3) 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3'端增加一个或多个脱氧核苷酸

4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构

第二节 DNA的切割反应

一,缓冲系统的组成

II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH75, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM

根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况:

高盐:100-150mM

中盐:50-100mM

低盐:0-50mM

二,酶切操作

DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-15hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高

单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量

三,酶切结果分析

(一) 酶切片段的检测

1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子

2) DNA分子的检测 a 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到

b 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子

(二)估计DNA分子的大小

根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)

D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变

也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右

四,多酶联合酶解

对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解;

对于对浓度要求不同的酶,可以:

1 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL

2 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 01体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min,干燥

五,定位酶切位点

建立酶切图谱需要一系列的酶

首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目;

然后进行双酶切;

比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱;

含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行

六, 限制性内切酶的star活性

在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下

第三节 DNA片段的连接

重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率在分子克隆的连接方式主要有以下几种:

一,连接方式

(一)相同粘性末端的连接

来源:

相同的酶

同尾酶

问题:

极性有两种可能

同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切称为"焊死"

(二)平头末端的连接

粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接

提高连接效率的方法:

加大酶用量(10倍)

加大平头末端底物的浓度

加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用

加入单价阳离子, 150-200mM NaCl

提高反应温度

平头连接同样存在两种极性

(三)不同粘性末端的连接

突出5'末端

Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接

突出3'末端

T4-DNApol切平,然后平头连接

突出末端不同

Klenow补平,或S1核酸酶切平

连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点)

(四)人工粘性末端的连接

5'突出的末端

外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化目的是:不使酶切位点遭受破坏

3'突出的末端

外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接

平头末端

可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段

(五)粘端与平端的连接

linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段

– 连接的效率较高

– 酶切时可能破坏DNA分子的完整

adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸

图 2-5 linker的连接方式

(六)粘性末端的更换

在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口

– BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端这样BamHI切口就换成了EcoRI切口

– 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI

二,重组率

重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比较为理想的重组率为25-75%

提高重组率的方法:

连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化

载体除磷 (磷酸酯酶5'除磷)

TdT在3'端增加人工粘性末端,防止载体自我环化