首先看你研究的基因组是不是已经测序了，如果是的话就方便了，去NCBI的FTP数据库下载基因组序列或者选择genome数据库输入名称就能查到，FASTA格式保存。推荐前一种方法，可以下载gbk文件，里面有所有已知基因的注释，用记事本就能打开看。再设计引物，FTP在首页最下面。如果研究未测序物种，就从同源性较高的其他物种寻找类似基因进行测序，以纤维素酶基CesA因为例，我原来克隆过这个，先从模式植物水稻中找到这个基因序列设计引物，当然如果在水稻或其他物种中已有人克隆了这个基因就可以直接用他的引物，因为同源性高一般来讲容易成功。其实最主要就是明确要克隆哪个基因，然后找到序列就能设计，或者用别人的引物，自己加以改进。至于引物设计软件比较权威的就是Primer Premier 5和oligo，前一种比较简单容易上手，后一种功能非常强大，稍微复杂一些，根据情况选择，当然如果不想动脑筋现在也有很多在线设计程序，谷歌一下就能搜到，把目标序列输进去默认参数点GO就OK了。其实设计引物也是一门技术活，有很多法则，网上也能找到。设计的好事半功倍，至于PCR其实没什么好学的，多做几次就会了，后面就是熟练的过程，等的时间比做的时间多。还有一点就是一般做真核生物通常都是提RNA反转cDNA来做，这样避免了内含子，因为真核生物内含子还是占了相当大的部分。得到外显子后其实就可以了，如果真的要完全克隆也可以用genewalk等特殊的酶来做，我也很久没做了，可能现在试剂更好了呵呵。

看你的要求

1楼那位同学的回答没有问题,通过在引物上设计酶切位点,做酶切、连接即可以连接两端基因

但如果你的这两段基因不好设计酶切位点,或者你不希望在这两段基因之间存在有其余的多余碱基,而且你又特别强调用PCR的方法去做连接,那么我推荐overlap-PCR把A基因3'端的序列加到扩增B基因的上游引物5'端,把B基因5'端的序列加到扩增A基因的下游引物的3'端分别扩增A、B两基因,这样A的3’端和B的5‘端就形成了互补切胶回收这两个PCR产物,稀释并混合,以此为模板,以A基因的上游引物和B基因的下游引物为引物对,扩增这样就可以得到AB拼接到一起的产物

具体的引物设计要求你可以多去看看overlap-PCR的文献,这种方法很方便的

标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液

10ul

4种dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

02ug

Taq

DNA聚合酶

25u

Mg2+

15mmol/L

加双或三蒸水至

100ul

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR

产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性

希望有所帮助

目的基因 PCR 分子生物学检测技术，通过扩增目的基因的特定区域来检测样本中是否存在该基因。其具体原理如下：

PCR（聚合酶链式反应）是体外扩增 DNA 片段的技术，利用特定的引物（primer）和酶，在高温和低温循环条件下使 DNA 片段逐步扩增。

目的基因 PCR 检测首先需要选定目标基因的特异性序列，并设计特异性引物。引物分别配对并结合在目的基因的两端，PCR 扩增需要参考目的基因的序列信息，以确保引物特异性和扩增产品的准确性。

将待检测的样本 DNA 提取出来，加入 PCR 反应体系中，并进行 PCR 扩增。在高温下，DNA 双链解旋，形成单链模板；在低温下，引物与单链模板相互结合，由 Taq 聚合酶在模板上伸长，合成新的 DNA 分子。经过多轮反复扩增，目标序列得以显著富集，可以通过各种检测手段进行分析和鉴定。

根据 PCR 反应产物的大小、数量等参数，利用凝胶电泳、荧光定量PCR、实时 PCR 等方法检测 PCR 扩增产物的存在情况，进而确定样本中是否存在目的基因。

目的基因 PCR 检测技术是一种简单而又快捷的检测手段，广泛应用于生物学、环境科学等领域。通过合理的引物设计和 PCR 反应优化，可以提高检测的特异性和灵敏度，为后续的分子分析和研究提供重要的数据支持。

有两种方法：

第一种从cDNA 文库(cDNA library )获得，如厦大韩家淮实验建立的免费cDNA 文库；

第二种从mRNA逆转录获得，在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来的基因组DNA相同而且无内含子；相反地，对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，与外显子序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。

真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

扩展资料：

cDNA 文库(cDNA library ): 是指某生物某一发育时期所转录的mRNA 全部经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA 文库与基因组文库的最主要的区别是，基因组文库含有而cDNA 文库不含非转录的基因组序列(重复序列等)。

与基因组文库- 一样，cDNA 文库也是指一群含重组DNA 的细菌或噬菌体克隆。每个克隆只含一种mRNA 的信息，足够数目克隆的总和包含了细胞的全部mRNA 信息。cDNA 文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达。

不论是由细胞总DNA 建立的基因组文库，还是由mRNA 逆转录而成的cDNA 建立的cDNA 文库，都是混合物，还要对文库进行筛选，直到获得目的基因。

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

参考资料：

-cDNA